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Detecting very low allele fraction variants using targeted DNA sequencing and a novel molecular barcode-aware variant caller #
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맞춤치료용 유전변이를 NGS로 혈액에서 찾기 위해 필요한 3가지

  1. wild-type DNA가 많은 가운데, rare mutation 포함 DNA fragment를 효과적으로 캡쳐해야 한다.
  2. deep coverage로 시퀀싱해야 한다.
  3. amplification과 sequencing 에러로 부터 낮은 수준의 진짜 변이를 구분해야 한다.

이를 위한 분자 바코드는 시퀀싱 오류 문제를 해결한다.

Summary #

Background #

2.5%의 variant를 calling하기 위해서는 1000x 이상의 deep sequencing이 추천됨

hybridization capture와 PCR amplicon 기반 enrichment 방식이 경제적 이유로 선호됨

낮은 빈도 변이 탐지에 deep sequencing만으로 충분치 않음. target enrichment workflow가 필요함.

낮은 변이 빈도와 누적되는 시퀀싱 오류는 나쁜 signal-to-noise를 만들고, false positive variant call을 구분하기 어렵게 한다. 무엇보다도, DNA fragments는 resampling bias 때문에 균일하게 증폭되지 않으므로, 측정된 variant allele fractions은 치우치고, 부적확한 탐지 결과를 낳는다.

분자 바코드 기술은 enrichment and sequencing artifacts를 줄이고, mutation 탐지 정확도를 높히기 위해 사용된다. 각각의 DNA 분자에 고유한 바코드가 붙고, 이를 통해 증폭 이후에 원래 클론을 찾을 수 있다. 정량은 고유한 바코드를 카운팅하기만 하면 된다.

생물정보 도구로 SNVSniffer, FaSD, MuTect이 변이 탐지로 사용된다. 이들은 바코드와 관련없다. 새로운 방법은 먼저 바코드로 consensus를 만들고, phred score도 이용해야 한다.

smCounter는 각 변이를 평가하기 위해 Bayesian probabilistic model을 사용한다.

Results #

Multiplex PCR enrichment with molecular barcodes #

DNA generation #

Overview, development, and performance of smCounter #

Variant calling on reduced barcode and read depth #

Cutoff selection #

Variant detection limit #

Discussion #

Conclusion #

Methods #

Preparation of in vitro sample mixtures #

Custom panel design #

Single primer enrichment protocol #

Read processing #

smCounter workflow #

Benchmarking variant calling performance #

Estimation of locus specific detection limit based on molecular barcode counts #

Incoming Links #

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